Thèse de Cédric Mittelheisser

Soutenance de thèse de Cédric Mittelheisser - laboratoire LASIRe

Résumé :

Parmi toutes les applications des protéines fluorescentes, leur utilisation comme marqueurs en microscopie de fluorescence est sans doute la plus répandue, une découverte marquée par le Prix Nobel de Chimie en 2008. Ces dernières années ont vu l'émergence des protéines photo-commutables réversibles (RSFPs) qui se caractérisent par une commutation réversible, photo-induite, entre un état fluorescent (ON) et un état non fluorescent (OFF). Leur intérêt se place en microscopie de fluorescence super-résolue (nanoscopie) pour atteindre des résolutions spatiales nanométriques (Prix Nobel de Chimie 2014). Les paramètres et vitesse d’acquisition de l’image tout comme la résolution sont étroitement liés aux propriétés photo-physiques et à la photo-dynamique de commutation de ces protéines. Aujourd’hui, les efforts se concentrent sur le développement de protéines fluorescentes photo-commutables fonctionnant dans le proche infrarouge, des longueurs d’onde idéales pour l’imagerie biologique en profondeur. Le groupe du Professeur Stefan Jakobs de l’Institut Max Planck pour les Sciences Interdisiplinaires à Göttingen a ainsi développé PENELOPE, la première RSFP fonctionnant en nanoscopie dans le proche infrarouge (λex = 690 nm, λem = 720 nm) avec retour thermique in vitro milliseconde. PENELOPE est un dérivé du bactériophytochrome sauvage de Deinococcus radiodurans (Dr-PSM). La forme stable de Dr-PSM absorbe dans le rouge (Pr, état ON) et se transforme sous irradiation en une forme absorbant dans le proche infrarouge (Pfr, état OFF). Le retour thermique est de l’ordre de quelques jours. Le développement de nouveaux mutants basés sur PENELOPE nécessitent une compréhension approfondie de son mécanisme de photo-commutation, en particulier pour identifier les espèces qui contrôlent ses rendements quantiques de fluorescence et de commutation, et son retour thermique rapide. La photo-commutation de Pr vers Pfr des bactériophytochromes sauvages implique plusieurs processus, dont l’isomérisation picoseconde cis-trans du chromophore biliverdine, des étapes de déprotonation et reprotonation millisecondes accompagnés de changements structuraux dans la protéine avec une formation de l’état final Pfr en une centaine de milliseconde. La photodynamique fait ainsi intervenir plusieurs états excités et intermédiaires dont les temps de vie couvrent quinze ordres de grandeurs, de la femtoseconde à la seconde. Dans cette thèse, la photodynamique de PENELOPE a été étudiée à l’aide de la spectroscopie optique résolue dans le temps de fluorescence et d'absorption transitoire UV-Vis-NIR, couvrant une gamme de temps allant de la femtoseconde à la seconde. Une comparaison est faite avec des variants de la protéine sauvage possédant (i) un retour thermique accéléré (Dr-CBDmono) ou étant (ii) fluorescents mais non photo-commutables (SNIFP). Cette comparaison a permis d’identifier deux états excités spécifiques qui contrôlent respectivement la fluorescence et l’isomérisation. La photo-activation de PENELOPE à partir de l’état ON (état Pr) se caractérise par la formation en quelques millisecondes de l’état OFF dont la signature en absorption visible et Raman est comparable à celle du précurseur de Pfr pour la protéine sauvage. Cet état OFF possède un retour thermique vers Pr d’une dizaine d’heures pour la protéine purifiée, accéléré de plusieurs ordres de grandeur in vitro, i.e. lorsqu’elle est exprimée dans E coli. Les résultats de ces études vont permettre la conception de nouveaux variants de bacteriophytochromes pour la nanoscopie en profondeur.

Mots clés : Photo-commutable,Proche infra-Rouge,Phytochrome,Photo-Dynamique,Protéine fluorescente,Spectroscopie