Thèse de Dana Simiuc

Amphithéâtre Pierre Glorieux - CERLA Soutenance de thèse de Dana Simiuc - Laboratoire Phlam Milieux dilués et optique fondamentale Mots-clés :dose de stress,dynamique,métabolisme,adaptation,peroxyde d'hydrogène,cellule unique Résumé : Les cellules vivantes, lorsqu'elles sont constamment exposées au stress, sont capables de réagir de manière complexe en faisant intervenir divers réseaux de régulation intracellulaire. Leur régulation contrôle par exemple le devenir cellulaire en réponse à un stress oxydatif. Lorsque les mécanismes défensifs parviennent à faire face au stress, une rétroaction négative est impliquée et la cellule survit,sinon la cellule meurt. L'un des principaux mécanismes défensifs repose sur l'interaction entre le flux métabolique et le stress oxydatif, exploitant le rôle dualiste du peroxyde d'hydrogène, agissant à la fois comme une molécule de signalisation et de dommages. Nos travaux visent à identifier les molécules clés impliquées dans le devenir cellulaire et à suivre leur dynamique au niveau de la cellule unique, à l'aide de la microscopie de fluorescense. Dans un premier temps, nous concevons un système expérimental inspiré des études de chimiotaxie pour contrôler en permanence la dose appliquée de peroxyde d'hydrogène (H2O2) à la lignée cellulaire du cancer du sein (MCF7). Le choix de la méthode de stimulation joue un rôle important dans notre étude. En effet, afin de délivrer une concentration constante de stimulus aux cellules de mammifères, un milieu de culture cellulaire H2O2 non réacti favec H2O2 est choisi. En utilisant un système fluidique, le taux de production intracellulaire de H2O2est contrôlé en faisant varier la concentration externe de H2O2. La délivrance et l'élimination du stimulus sont ainsi effectuées assez rapidement (plus rapidement que la consommation cellulaire) pour étudier les réponses cellulaires dynamiques. Lors d'une stimulation constante, une dynamique d'adaptation est observée, ce qui suggère que des rétroactions négatives sont impliquées dans la protection cellulaire contre le stress. La variabilité d'une cellule à l'autre est observée et quantifiée à l'aide de paramètres d'adaptation identifiés. Des résultats préliminaires de la dépendance de la modulation du pH par l'état métabolique cellulaire sont discutés. Les caractéristiques d'adaptation ne sont pas représentées lorsque les sources de carbone sont complètement éliminées du milieu externe.Ce résultat souligne le rôle du glucose dans le mécanisme de défense cellulaire. Un autre résultat important est celui de la dynamique de rétroaction qui dépend de la dose de H2O2 appliquée aux cellules: une stimulation plus forte implique une réponse plus forte. C'est un premier facteur limitant que nous avons identifié lors de la quantification de la réponse de mort cellulaire au stress H2O2. Les résultats de la réponse à la dose de mort cellulaire suggèrent que le destin de la cellule (survie ou mort) dépend également à la fois du contrôle du stimulus et de l'état métabolique cellulaire. Afin d'identifier les voies métaboliques impliquées dans la rétroaction négative induite par le stress oxydatif, des molécules clés régulant la voie Phosphate Pentose (PPP) sont modulées. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que le PPP n'est pas le seul réseau impliqué dans la défense cellulaire. Nous concluons que l'orchestration du réseau moléculaire est plus complexe et que PPP est le réseau principal mais pas le seul impliqué dans la défense cellulaire. Dans ce manuscrit, une conception expérimentale est présentée afin d'étudier les réponses d'adaptation austress oxydatif observée en temps réel. Nos expériences confirment la cinétique d'adaptation rapide duNAD(P)H déjà observée dans la littérature. Nous identifions, pour la première fois, un deuxième mécanisme de régulation où le système de glutathion se rétablit en 30 min pendant la stimulation contrôlée par H2O2. Le métabolisme du glucose soutient la régénération de ce système antioxydant etle réseau PPP est ainsi identifié comme le principal retour négatif dans l'adaptation moléculaireobservée ici.